시료와 시료 전처리

시료 전처리

시료와 시료 전처리

시료와 시료

시료는 옥수수 시료 6 종과 콩 시료 5 종을 사용하였다. 옥수수 시료로는
옥수수가루,옥수수 스프,옥수수식빵믹스,나쵸,옥수수 통조림 등 옥수수 가공식품 5 종과 원료 옥수수를 사용하였다. 콩 시료는 원료 콩인 백태,콩나물,
된장,두부,두유 등을 사용하였다. 가공식품은 시중에서 판매되는 제품을
구매하였다. 옥수수 통조림과 된장 시료는 이물질을 제거하기 위해 멸균수로 10 회
씻어 주었다. 시료와 시료 수분을 포함한 시료와 세척된 시료는 65°C의

DRY OVEN (DRY OVEN HK-DO135F, 한국종합기기제작소,Korea) 에서 1 일〜 2 일 동안
건조하였다[7]. 시료 중 고형상은 액체질소와 막자 사발을 이용하여 완전히 분쇄하였고 분쇄한 시료는 DNA 추출에 사용되었다[16]. 옥수수 시료는 lg,콩 시료는 0.5g 을 사용하였다.

DNA 추출

옥수수와 콩 시료에 대해 CTAB, magnetic bead, 그리고 silica gel membrane 법 등 3 가지 추출방법을 사용하여 Genomic DNA 를 추출하였다.

Magnetic bead 법은 DNA Purification System For Food (Promega, Madison, MI, USA) 라는 kit 를 사용하였고 silica gel membrane 법은 DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하였다.

CTAB 법은 식품의약품안전청 고시에 나와 있는 시료와 시료 방법을 사용하였다.

magnetic bead, silica gel membrane 법은 manufacturers5 instructions 대로 추출을 진행하였다. 모든 시료에 대해
3 회 반복하여 DNA 를 추출하였다.

(1) CT AB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 법

분쇄한 시료(옥수수 시료 1 g, 콩 시료 0.5 g)를 폴리프로필렌 튜브(50 mL 용)에넣고,CTAB 완충액 5~10 mL 을 가하여 혼합기 (vortex mixer)로 잘 섞은 후,55 °C에서 30 분간 반응시킨다. 이때 10 분마다 10 초간 혼합기를 사용하여 시료와반응액이 충분히 혼합되도록 한다.

30 분간 반응시킨 후,혼합기로 충분히 혼합하여균질화한 용액

1 mL 를 2 mL 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 (PCI) 500pl 를 가하여 잘 혼합한 다음

12,000 g 로 15 분간 실온에서 원심 분리한다.

원심분리 후 중간층에 닿지 않도록 하여 상층액을 새로운 시료와 시료 1.5 mL 튜브에 옮긴 후,클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 (CIA) 500 pl 를 가하여 혼합기를 이용하여 잘혼합한 후,12,000 g 로 15 분간 실온에서 원심 분리한다.

다시 상층액을 새로운1.5 mL 튜브에 옮기고 동량(500 yl) 의 이소프로필알코올을 가하여 상하로 10 회정도 뒤집어 준 후,12,000 g 로 실온에서 10 분간 원심 분리한다. 맑은 상층액을버리고,

침전물에 500 yl 의 70 % 에탄올을 가한 후 12,000 g 로 1 분간 실온에서원심 분리한 후,

침전물에 닿지 않도록 상층액을 마이크로피펫으로 제거하고침 전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘 발될 정도로만 건조시 킨다.

TE 완충액 (pH 8.⑴50 pl 를 가하여 잘 혼합하고,실온에서 15 분간 때때로 흔들어주면서 완전히녹인다. 추출된 DNA 를 정제하기 위하여 위의 용액에 RNase A (10 mg/mL) 5pl 를 가하여 37 °C에서 30 분간 정치한다. 반응 후,200 pl 의 CTAB 완충액과클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 (CIA) 250 pl 를 가하여 혼합기로 가볍게혼합하여,

실온에서 12,000 g 로 15 분간 원심 분리한다. 상층액을 새로운 1.5 mL튜브에 옮긴 후,200 ul 의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10 회 정도 뒤집어 준후,12,000 g 로 10 분간 실온에서 원심 분리한다. 시료와 시료 침전물에 닿지 않도록마이크로피펫으로 상층액을 버리고,200 pl 의 70 % 에탄올을 가하여 침전물을씻어낸 후,

다시 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거한다.

12,000 g 로 1 분간실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후,침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다.

시료와 시료 건조된 침전물에 50pl 의 멸균수를 가하고 4 OC에서 12~24 시간 정치하면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다. DNA 용액은 사용 전까지 -20 °C에 보관하였다

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