정성 PCR 분석

정성 PCR 분석

정성 PCR 효율은 template 로 사용되는 DNA 의 quality 에 영향을 받는입니다.
가공식품의 경우 가공과정에서 열이나 염 등의 처리에 의하여 template 로 사용될 DNA 가 분해되고 이에 따라 PCR 효율에 영향을 미칠 것으로 예측됩니다. 특히,
식품의약품안전청 유전자재조합 식품 검사지 침에서는 PCR 산물이 200 bp 이상으로
프라이머를 설계하는 경우 가공품 분석에 적합하지 않은 것으로 보고되고 있어,

본 실험에서는 PCR 산물이 100 bp 와 118 bp 가 되도록 제작된 프라이머를
사용하였다[9]. 추출된 DNA 를 일정농도(50 ng/pl)로 희석하여 template 로
이용하고,옥수수와 콩의 내재유전자를 증폭시킬 수 있는 primer 를 이용하여 PCR 을 수행하였습니다. 그 결과,positive control 인 원료 옥수수와 원료 콩과
비교했을 때 거의 차이가 없이 모든 시료에서 내재 유전자를 확인하였다(Figure 6). 다만,

두유에서 silica gel membrane 법으로 추출한 DNA 의 PCR 결과에서 다른 시료들에 비해 매우 낮은 민감도를 보였다(Figure 6 (B)).

Real-time PCR 분석

R e a l – t i m e P C R 은 D N A 양을 정량하기 위해 사용되어왔습니다. 그러므로 R e a l ­ time PCR 기술은 식물,옥수수와 콩,이들의 가공식품에서 GMO 를 정량적으로 검출할 수 있다[18]. Real-time PCR 의 Ct 값은 높은 quality 의 DNA 를 얻을 수
있는 가장 적합한 추출방법을 결정하는데 사용될 수 있습니다. 순도가 높은 DNA 일
수록 순도가 낮은 DNA 에 비해 더 작은 Ct 값을 갖기 때문입니다. 정성 PCR 이나 Real-time PCR 은 옥수수 가공식품으로부터 효율적인 DNA 추출 방법을 찾는데 사용되어 왔다[5, 14]. 본 연구에서는 Ct 값의 통계 분석을 통해 3 가지 방법 별로 각각의 시료에서 추출한 DNA 의 가장 높은 quality 를 갖는 DNA 를 추출할 수 있는 효율적인 방법을 찾는 실험을 수행하였습니다.

옥수수 시료

옥수수 시료의 Real-time PCR 결과,모든 시료에서 silica gel membrane 법이

CT AB 법과 magnetic bead 법과 유의적인 차이를 나타냈다 (Table 6).

6 개의 모든 시료에서 silica gel membrane 법으로 추출한 DNA 가 가장 작은 Ct 값을 나타내어 가장 증폭 효율이 좋은 것으로 나타났다(Figure 7). 반면에 이전의 연구에서 Real-time PCR 로 내재 유전자의 copy number 를 비교한 결과, 가장 효율적인 추출방법으로 magnetic bead 법인 Wizard® 법이라고 보고된 것과 다른 결과를 얻었습니다. 그러나 모든 옥수수 시료에서 silica gel membrane 법이 높은

값을 나타내어 Ct 값의 비교 결과와 일치하였습니다. 나쵸와 옥수수 통조림을

제외한 옥수수 시료에서 두 번째로 좋은 효율을 보이는 추출 방법은 CTAB 법입니다.

나쵸와 옥수수 통조림의 경우는 CTAB 법 보다 magnetic bead 법에서

더 좋은증폭 효율을 보였습니다. 이러한 결과는 나쵸가 DNA 추출을 저해하는 오일을 포함하고 있고,

magnetic bead 법이 가공식품에서 DNA 를 추출할 수 있도록 개발된 kit 이 기 때문이 입니다.

콩 시료

옥수수의 Real-time PCR 결과와 마찬가지로,콩 시료들도 두유를 제외한 모든 시료에서 silica gel membrane 법으로 추출한 DNA 가 가장 작은 Ct 값을 나타내어 가장 증폭 효율이 좋은 것으로 나타났다(Table 7).

반면 두유의 경우는 DNA 추출이 가능하였으나 Real-time PCR 결과 콩의 내재유전자의 증폭 산물이 관찰되지 않았다(Figure 8).

이는 추출된 DNA 가 콩에서 유래된 것보다는 기타 배합성분에서 유래된 DNA 등의 물질이 많은 비율로 포함되어 있었고 Real-time PCR 은 정성 PCR 보다 더 민감하기 때문이라고 추정된다.

두유에서 silica gelmembrane 법으로 추출한 DNA 의 내재 유전자가 증폭하지 않았기 때문에
제외시키면,그 다음으로 가장 효율적인 추출방법은 원료 콩과 콩나물은 CTAB 법이며 된장과 두부는 magnetic bead 법입니다.

된장과 두부의 경우 원료 콩과 콩나물에 비해 훨씬 많은 가공과정을 거쳤기 때문에 magnetic bead 법에서 좋은 추출 효율을 나타내었습니다.

Real-time PCR 의 수치화된 Ct 값 data 는 Table 6 와 Table 7 에 나타내었습니다.

결 론

다양한 가공공정을 거친 가공식품에서의 DNA 추출은 식품 분석의 기본 단계로 매우 중요한 부분입니다.

추출된 DNA 의 quality 가 가장 중요한 평가 요소가 되며 그 중에서

integrity 와 purity 가 큰 영향을 끼치는 중요한 요소입니다.
본 연구에서는 원료 옥수수와 콩,이것들을 원료로 한 가공식품에서 가장 효율적인 추출 방법을 찾기 위한 실험을 수행하였습니다.
옥수수 시료의 경우,CTAB 법이 가장 높은 DNA 수율을 나타내었지만

A26O/A23o 비와 Real-time PCR 결과 silica gel membrane 법이 가장 높은 DNA quality 를나타내었습니다.

옥수수는 탄수화물 함량이 높기 때문에 탄수화물을 효과적으로 제거할 수 있는 방법이 가장 효율적인 추출 방법입니다. 따라서 silica gel membrane 법이
옥수수 식품에서 순도 높은 DNA 를 추출할 수 있는 가장 효율적 인 추출 방법 이 입니다.

콩 시료의 경우,옥수수 결과와 마찬가지로 가장 높은 DNA 수율을 나타내는 것은 CTAB 법이었습니다.

그리고 콩의 모든 시료에서 A26O/A28o 비와 A26o/A23o 비
모두에서 C T A B 법으로 추출한 D N A 의 순도가 가장 높았습니다. R e a l – t i m e P C R
결과 두유를 제외한 모든 시료에서 s i l i c a g e l m e m b r a n e 법이

가장 높은 D N Aq u a l i t y 를 나타내었습니다.

하지만 두유에서 s i l i c a g e l m e m b r a n e 법으로 추출한
DNA 가 증폭하지 않았기 때문에 이 방법을 제외하면,원료 콩과 콩나물은 CTAB
법이 가장 좋은 증폭 효율을 보였고 된장과 두부의 경우는 magnetic bead 법이 가장 좋은 증폭 효율을 보였습니다.

하지만 DNA 수율은 CTAB 법이 magnetic bead
법 보다 약 2 배~8 배 정도 훨씬 높입니다. 단백질 함량이 높은 콩 식품에서

단백질을효과적으로 제거할 수 있는 추출 방법이 가장 효율 적인 추출 방법입니다.

따라서A260/A280 비에서 높은 순도를 나타내고 수율도 높은 CTAB 법이 콩을 원료로 한식품에서

수율과 순도가 높은 DNA 를 추출할 수 있는 가장 효율적인 추출방법입니다.

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