GMO검출법 추천방법

GMO검출법 추천방법

GMO검출법 추천방법

정성 PCR 분석

GMO 검출법으로 가장 널리 사용되고 있는 방법으로 GMO 및 이를 이용한 가공식품으로부터 추출된

genomic DNA 를 template 로 하여 도입 유전자의염기서열에 특이적으로 결합하는

프라이머 (primers)를 제작하여 target DNA 를 증폭함으로써 제한된 시료를 수 시간 이내에 정성분석이 가능한 방법이다


GMO검출법 는 옥수수와 콩에 각각 특이적인 내재 유전자Cs&rcA synthase (SSIIb) and lectin gene)를 증폭하여 확인하였다. PCR 정성분석에 사용한 primer 와 그 정보는 table 3 에 요약하였다. PCR 반응용액의 조성은 Ampli Taq
Gold™ DNA polymerase (Applied Biosystems, USA) 0.16 pl (0.625 unit),dNTPs (Applied Biosystems, USA) 2 pl (200 pM), 10 x PCR buffer (AppliedBiosystems, USA)

2.5 pl, MgCl2 (Applied Biosystems, USA) 1.5 pl (1.5 mM),primer (Bionics, Korea)

1 pl (각 0.5 “M), template DNA 1 pl (50 ng/ pl)

로최종 반응액이 25 pl 가 되도록 조성하였다.

PCR 은 Astec PC808 (Astec,Japan)< 이용하여 SS77&-specific PCR 의 경우,94 °C에서 5 분간 최초 변성을 시킨 후,94 °C에서 30 초,61 °C에서 30 초,72 °C에서 30 초를 1 회 반복으로하여 40 회 반복하고 마지막으로 72 °C에서 7 분간 최종 신장 하였다. Lectin- specific PCR 반응 조건은 95 °C에서 10 분간 최초 변성을 시킨 후,

95 °C에서30 초,60 °C에서 30 초,72 °C에서 30 초를 1 회 반복으로 하여 GMO검출법 40 회 반복하고 마지막으로 72 °C에서 7 분간 최종 신장하였다.

PCR 반응에 의한 증폭 결과는 2 % (w/v) agarose gel 에 PCR 증폭산물 3 사1 를 loading 하여

100 volt 로 17 분간 전기영동 하였고 marker 로는 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea) 를 사용하였다.

전기영동 결과는 카메라로 촬영하여 확인하였다.

Real-time PCR 분석

Real-time PCR 분석은 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 다음과 같은 조건에서 실험을 수행하였다. 50 °C에서 2 분, 95 °C 에서 10 분간 pre-incubation 시킨 후,

95 OC에서 15 초,60 OC 에서 10분으로 하여 50 cycle 을 수행하였다.

반응용액의 조성은 template DNA 50 ng,Universal Master Mix

(Applied Biosystems, USA) 12.5 pl, 0.5 pM primer pairs,0.2 pM probe 를 넣어 최종 반응액이 25 pl 가 되도록 하였다. Real-time PCR 은
GMO검출법 분석용 시료 1 점당 3 well 로 반복 분석하고,well 당 반응용액은 25 pl 로 하였다.
PCR 대조구는 DNA 를 넣지 않은 음성 대조구(NTC)를 사용하였다. Real-time PCR 후,RT-PCR 시스템에 의해 Ct 값을 구하였다. 재현성 확인을 위해 real­time PCR 분석을 3 회 반복하였고

data 는 세 실험 중 한가지 data 를 사용하였다. Real-time PCR 분석에 사용한 primer 와 그 정보는 Table 3 에 요약하였다.

통계 분석

GMO검출법모든 실험은 3 회 반복 측정 하였으며 각 data 는 평균과 표준오차로 나타내었다.

3 가지 방법으로 추출한 DNA 의 수율,순도 그리고 Real-time PCR 의 효율 (Ct 값)에 대한 결과 값을

통계처리 프로그램인 SAS (Statistical analysis program) software version 8 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 을 이용하여

5% 유의 수준에서 평균값과 표준편차 그리고 Duncan’ s multiple range test 로 평균간의 다중비교를 실시하였다.

https://icecw.co.kr/%ec%a0%95%ec%84%b1-pcr-%eb%b6%84%ec%84%9d-%ed%95%b4%ec%84%9c-%ec%95%8c%eb%a0%a4%eb%93%9c%eb%a6%bd%eb%8b%88%eb%8b%a4/

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