Magnetic bead 법

Magnetic bead

Magnetic bead 법

(DNA Purification System For Food (Promega, Madison, MI, USA))

분쇄한 시료(옥수수 시료 1 g, 콩 시료 0.5 g) 를 폴리프로필렌 튜브(50mL 용)에 넣고

2.5 mL 의 Lysis Buffer A 와 25 pl 의 RNase A 를 가하여

혼합기 (vortex mixer) 로 잘 섞 어준다.

1.25 mL 의 Lysis Buffer 를 가해 혼합기로10-15 초 정도 섞어 준 후

상온에서 10 분 정치시킨다. 그 후,3.75 mL 의 Precipitation solution 을

넣어 혼합기로 잘 섞어 3,000-5,000 g 에서 10 분간원심 분리 한다.

원심 분리 후,상층액을 새 폴리프로필렌 튜브 (50 mL 용)에옮겨 100 pl 의 MagneSil PMPs 를 가하여 혼합기로 잘 섞어준다. 상층액 부피의0.8 배의 이소프로필알코올을 가하여 튜브를 상하로 10〜15 회 정도 뒤집어 준 후,

5 분간 정치시킨다.

그 후,Magnetic bead PolyATract System 1000 Magnetic separationstand 에 1 분간 세워 놓은 후 마이크로피펫으로 용액을 제거한다.

stand 로부터튜브를 분리해 1.25 mL 의 Lysis Solution B 를 가해준 뒤

튜브를 상하로 2~3 회 정도 뒤집어 주고 Stand 에 1 분간 정치시킨 후 마이크로피펫으로 용액을 제거한다.


5 mL 의 70 % Magnetic bead 에탄올을 가해 Stand 에 1 분간 정치시킨 후 마이크로피펫으로 용액을 제거한다.

에탄올로 washing 하는 과정을 3 회 반복한다. 에탄올 증발을 위해 65 °C에서 10 분간 말린 후,

100~400 pl 의 멸균수를 넣고 혼합기로 섞어 65 °C에서 5 분간 정치시킨다.

튜브를 스탠드에 1 분간 세워 둔 후 용액을 새 튜브에 옮겨 이를 DNA 시료 원액으로 한다. DNA 용액은 사용 전까지 -20 °C에 보관하였다.

silica gel membrane 법 (DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA))

분쇄한 시료(옥수수 시료 1 g, 콩 시료 0.5 g) 에 5 mL 의 API 버퍼와

10 pl 의 RNase A (100 mg/ml)를 가하여 혼합기로 잘 섞어 65 OC에서 10 분간 incubation시킨다.

이 때 10 분 동안 2〜3 번 튜브를 뒤집어주며 섞어준다.

1.8 mL 의 AP2 버퍼를 넣고 섞어 준 후 얼음에서 10 분간 정치시킨다.

상온에서 3,000-5,000 g 로 5 분간 원심분리 한 후,Magnetic bead QIAshredder Maxi Spin Column 에 상층액을 넣고 같은조건으로 원심분리를 한다.

컬럼을 통과한 용액을 새 튜브(50 mL 용)로 옮기고 용액 부피의 1.5 배의 AP3 버퍼를 넣고 혼합기로 섞어준다.

이 용액을 DNeasyMaxi Spin Column 에 넣고 상온에서 3,000〜5,000 g 로 5 분간 원심 분리한다.

컬럼 통과액은 버리고 12mL 의 AW 버퍼를 컬럼에 넣고 3,000-5,000 g 로10 분간 원심 분리한다.

원심 분리 후,컬럼을 새 튜브(50 mL 용)에 옮기고멸균수를 넣어

상온에서 5 분간 정치시킨 후에 3,000-5,000 g 로 5 분간 원심 분리한다.

컬럼을 통과한 DNA 용액은 사용 전까지 -20 °C에 보관하였다.

DNA 농도 및 순도 측정

DNA 의 능도 및 순도는 분광광도계법과 전기영동법을 사용하여 측정하였다.DNA 시료 원액을 멸균수로 희석하여 230, 260, 280 nm 에서 분광광도계 (UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER, PharmaSpec UV-1700, SHIMADZU, Japan)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 260 nm 에서 흡광도가 1 일 때의 DNA 의 농도는 50 ng/ yl 이므로 추출한 DNA 의 농도(ng/yl)는 260 nm 에서의 흡광도 X 50 X 희석배수로 하여 계산하였다[11,16]. 순도는 260/280 nm 와260/230 nm 의 흡광도 비로 계산 하였다[11].

1 % (w/v) agarose gel (BIO­ RAD, USA)을 전기 영동기 (Mupid, Advance, Japan) 에 설치 한 후

추출한 DNA 를600 ng loading 하여 50 volt 로 25 분간 전기영동 하였고 marker 로는 A /Hindin (Bioneer, Korea)를 사용하였다.

전기 영동이 끝난 후 UV transilluminator (Vilber Lourmat, France) 위에

gel 을 을려 CCD 카메라(Nikon Coolpix 4300, Japan)로 촬영하고 화상데이터로 보존하였다.

Leave a Comment

안녕하세요